Próitéináis K mNGS (leachtach)
Is protease serine cobhsaí é Proteinase K le sainiúlacht leathan substráit.Díghrádaíonn sé go leor próitéiní sa stát dúchais fiú i láthair glantach.Léiríonn fianaise ó staidéir ar struchtúir chriostail agus mhóilíneacha go mbaineann an einsím leis an teaghlach subtilisin le suíomh gníomhach triad catalaíoch (Asp39-A chuid69-Seir224).Is é an príomhshuíomh scoilteachta ná an banna peptide in aice leis an ngrúpa carboxyl d'aimínaigéid alafatacha agus aramatacha le aimínghrúpaí blocáilte.Úsáidtear go coitianta é as a shainiúlacht leathan.Tá an proteinase K seo deartha go speisialta do mNGS.I gcomparáid leis an proteinase K eile, tá sé fiú níos lú éillithe aigéid núicléasaigh leis an fheidhmíocht einsímeach céanna, a d'fhéadfadh a chinntiú níos fearr a chur i bhfeidhm mNGS iartheachtacha.
Coinníollacha Stórála
2-8 ℃ ar feadh 2 bhliain
Sonraíocht
| Dealramh | Gan dath go leacht donn éadrom |
| Gníomhaíocht | ≥800 U/ml |
| Tiúchan Próitéin | ≥20 mg/ml |
| Nicáis | Níor braitheadh aon cheann |
| DNA | Níor braitheadh aon cheann |
| RNase | Níor braitheadh aon cheann |
Airíonna
| Uimhir CE | 3.4.21.64(Athchuingreach ón albam Tritirachium) |
| Pointe isealeictreach | 7.81 |
| pH is fearr | 7.0- 12.0 Fíor 1 |
| Teocht is fearr | 65 ℃ Fíor 2 |
| cobhsaíocht pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) Fíor 3 |
| Cobhsaíocht theirmeach | Thíos 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fíor 4 |
| Cobhsaíocht stórála | Gníomhaíocht níos mó ná 90% ar feadh 12 mhí ag 25 ℃ |
| Gníomhaitheoirí | SDS, úiré |
| Coscairí | Fluarafosfáit diisopropyl;fluairíd feinilmethylsulfonyl |
Feidhmchláir
1. Trealamh diagnóiseach géiniteach
2. Feisteáin asbhainte RNA agus DNA
3. Comhpháirteanna neamhphróitéine a bhaint as fíocháin, díghrádú neamhíonachtaí próitéine, mar shampla DNAvacsaíní agus ullmhú heparin
4. DNA crómasóim a ullmhú trí leictreafóiréis bhíogach
5. Blot an Iarthair
6. Diagnóis in vitro imoibrithe albaimin glycosylated einsímeacha
Réamhchúraimí
Caith lámhainní cosanta agus gloiní cosanta agus tú ag úsáid nó ag meáchan, agus coinnigh aeráil mhaith tar éis é a úsáid.Féadfaidh an táirge seo a bheith ina chúis le frithghníomhú ailléirgeach craiceann agus greannú súl tromchúiseach.Má dhéantar é a ionanálú, féadfaidh sé a bheith ina chúis le hairíonna ailléirge nó asma nó dyspnea.D'fhéadfadh sé a bheith ina chúis le greannú riospráide.
Sainmhíniú aonaid
Sainmhínítear aonad amháin (U) mar an méid einsím a theastaíonn chun cáiséin a hidrealú chun 1 μmol a tháirgeadhtyrosine in aghaidh an nóiméid faoi na coinníollacha seo a leanas.
Ullmhúchán imoibrithe
Imoibrí I: tuaslagadh 1g cáiséin bainne i 50ml de thuaslagán fosfáit sóidiam 0.1M (pH 8.0), gortha i 65-70 ℃ uisce ar feadh 15 nóiméad, stir agus tuaslagtha, fuaraithe le huisce, arna choigeartú ag hiodrocsaíd sóidiam go pH 8.0, agus méid seasta 100ml.
Imoibrí II: aigéad trichloroacetic 0.1M, aicéatáit sóidiam 0.2M, aigéad aicéiteach 0.3M.
Imoibrí III: 0.4M Na2CO3réiteach.
Imoibrí IV: Forint imoibrí caolaithe le huisce íon ar feadh 5 huaire.
Imoibrí V: Caolaitheoir einsím: tuaslagán fosfáit sóidiam 0.1M (pH 8.0).
Imoibrí VI: tuaslagán tyrosine: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol / ml tyrosine tuaslagtha le 0.2M HCl.
Nós imeachta
1. Déantar 0.5ml d'imoibrí I a réamhthéamh go 37 ℃, cuir 0.5ml de thuaslagán einsíme, measc go maith, agus gor ag37 ℃ ar feadh 10 nóiméad.
2. Cuir 1ml d'imoibrí II leis chun an t-imoibriú a stopadh, measc go maith, agus lean ar aghaidh leis an gor ar feadh 30 nóiméad.
3. Tuaslagán imoibrithe lártheifneora.
4. Tóg 0.5ml comhshnáthán, cuir imoibrí 2.5ml III, 0.5ml imoibrí IV, measc go maith agus gor ag 37 ℃ar feadh 30 nóiméad.
5. OD660cinneadh mar OD1;grúpa rialaithe bán: úsáidtear imoibrí 0.5ml V chun einsím a athsholátharréiteach chun OD a chinneadh660mar OD2, OD=OD1-OD2.
6. Cuar caighdeánach L-tyrosine: 0.5mL tiúchan difriúil tuaslagán L-tyrosine, 2.5mL Imoibrí III, 0.5mL Imoibrí IV i 5mL feadán lártheifneoir, gor i 37 ℃ ar feadh 30 nóiméad, a bhrath le haghaidh OD660do thiúchan éagsúil L-tyrosine, fuair ansin an cuar caighdeánach Y=kX+b, áit arb é Y an tiúchan L-tyrosine, is é X OD600.
Ríomh
2: Toirt iomlán an tuaslagáin imoibrithe (mL)
0.5: Toirt an tuaslagáin einsíme (mL)
0.5: Toirt leachta imoibrithe a úsáidtear i gcinneadh crómaigineach (mL)
10: Am freagartha (nóiméad)
Df: caolú iolra
C: tiúchan einsím (mg/mL)
Tagairtí
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Bithfhis.Res.Cumann.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Bithcheimic.(1975);56:103-108.
4. Sambrook Jet al., Clónáil Mhóilíneach: Lámhleabhar Saotharlainne, 2ú eagrán, Cold Spring HarbourLaboratory Press, Cold Spring Harbour (1989).
Figiúirí
Fig.1 is fearr pH
Tuaslagán maolánach 100mM: pH6.0-8.0, Na-fosfáit;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Tiúchan einsím: 1mg/mL
Fíor.2 An teocht is fearr
Imoibriú i maolán K-fosfáit 20 mM pH 8.0.Tiúchan einsím: 1 mg/mL
Fig.3 pH Cobhsaíocht
25 ℃, 16 h-cóireáil le tuaslagán maolánach 50 mM: pH 4.5- 5.5, Aicéatáit;pH 6.0-8.0, Na-fosfáit;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH.Tiúchan einsím: 1 mg/mL
Fíor.4 Teirmeach cobhsaíocht
Cóireáil 30 min le maolán Tris-HCl 50 mM, pH 8.0.Tiúchan einsím: 1 mg/mL
Fig.5 Stóráil stability at 25 ℃
