Clár plasma maxi saor in aisce,
Tá an trealamh seo oiriúnach le haghaidh eastóscadh ó 150 – 300 ml de thuaslagán baictéarach a shaothraítear thar oíche, ag baint úsáide as modh lysis alcaileach feabhsaithe SDS chun na baictéir a líseáil.Déantar an t-amhshliocht a chomhcheangal go roghnach le Scavenger Endotoxin uathúil agus scartha trí lártheifneoiriú chun endotoxins a bhaint.Ansin, ceanglaíonn an membrane glóthach shilice go roghnach le DNA plasmid sa tuaslagán faoi choinníollacha ard-salann agus íseal-pH.Ina dhiaidh sin cuirtear maolán níocháin leis chun eisíontais agus comhpháirteanna baictéaracha eile a bhaint.Ar deireadh, úsáidtear maolán íseal-salann, ard-pH elution chun DNA plasmid íon a bhaint as an scannán maitrís sileacain.Fostaíonn an membrane glóthach shilice membrane asaithe speisialta, agus tá an difríocht méid asaithe idir an colún agus an colún an-bheag agus tá an atrialltacht maith.Níl gá le feanól, clóraform agus imoibrithe tocsaineacha eile, agus níl céimeanna deascadh eatánóil ag teastáil ach an oiread.Is féidir an trealamh seo a úsáid chun 0.2 -1.5 mg de DNA plasmid ardchóip íon a bhaint go tapa, le ráta eastósctha 80% -90%.Úsáideann an trealamh foirmle próiseas uathúil chun deireadh a chur le endotoxin, tá an t-ábhar endotoxin an-íseal agus tá an éifeacht aistrithe cille den scoth.D'fhéadfaí an plasmid asbhainte a úsáid go díreach i ndíleá einsímí, PCR, trascríobh in vitro, claochlú, seicheamhú agus turgnaimh bhitheolaíocht mhóilíneach eile.
Coinníollacha stórála
Ba chóir RNaseA a stóráil ag -30 ~ -15 ℃ agus a iompar ag ≤0 ℃.
Is féidir Endotoxin Scavenger a stóráil ag 2 ~ 8 ℃ ar feadh míosa, a stóráil ag -30 ~ -15 ℃ le haghaidh stórála fadtéarmachagus a iompar ag ≤0 ℃.
Ba cheart comhpháirteanna eile a stóráil ag teocht an tseomra (15 ~ 25 ℃) agus a iompar ag teocht an tseomra.
Comhpháirteanna
| Comhpháirteanna | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Maolán P1 | 75 ml |
| Maolán P2 | 75 ml |
| Maolán P4 | 75 ml |
| Scavenger Endotoxin | 25 ml |
| Maolán PW | 2 × 22 ml |
| TB Maolán | 20 ml |
| Colúin FastPure DNA Maxi (gach ceann i bhfeadán bailiúcháin 50ml) | 10 |
| Feadán Bailiúcháin saor ó Endotoxin | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, a úsáidtear chun RNA a bhaint.
Maolán P1:maolán fionraí baictéarach, cuir RNAseA le Buffer P1 roimh é a úsáid den chéad uair.
Maolán P2:maolán lysis baictéarach (ina bhfuil SDS/NaOH).
Maolán P4:maolán neodraithe.
Scavenger Endotoxin:bhaint go héifeachtach endotoxin as an sliocht plasmid amh.
Maolán PW:maolán nigh, cuir an méid eatánóil ordaithe roimh é a úsáid den chéad uair.
TB Maolán:maolán elution.
Colúin FastPure DNA Maxi:colúin asaithe DNA plasmid.
Feadáin Bailiúcháin 50 ml :feadáin bhailiúcháin scagairí.
Feadán Bailiúcháin saor ó Endotoxin:feadáin bhailiúcháin DNA plasmid.
Ábhair Ullmhaithe
Absalóideach eatánól, iseapropanól, feadáin lártheifneoir bunchruinn 50 ml agus 50 ml saor ó in-ocsainefeadáin lártheifneoir.
Feidhmchláir
Tá an táirge seo oiriúnach le haghaidh eastóscadh ar scála mór plasmids ó 150 - 300 ml de thuaslagán baictéarachsaothraithe thar oíche.
Próiseas Turgnaimh
1. Glac 150 – 200 ml (gan níos mó ná 300 ml) de thuaslagán baictéarach saothraithe thar oíche agus lártheifneoir agthart ar 11,000 rpm (12,000 × g) ar feadh 1 - 2 nóiméad.Caith amach an súthach agus bailigh na baictéir.
Δ Nuair a bhíonn níos mó ná 50 ml de thuaslagán baictéarach á bhailiú, is féidir na baictéir a bhailiú trí thuaslagán baictéarach, lártheifneoiriú, sásadh agus céimeanna eile a chaitheamh sa fheadán 50 ml céanna le haghaidh
amanna iolra.
2. Cuir 7.5 ml de Mhaoláin P1 leis (féach an bhfuil RNAseA curtha le Maolán P1) leis an lártheifneoirfeadán ina bhfuil baictéir agus meascáin go maith trí vortex nó pípéad.
Δ Tá athfhriotú iomlán na mbaictéar sa chéim seo ríthábhachtach chun toradh a bhaint amach, agus níor cheart go mbeadh aon chnapanna baictéaracha ann tar éis athfhriotú.Má tá clumps baictéarach nach bhfuil measctha go críochnúil, beidh tionchar aige ar an lysis, rud a fhágann go mbeidh toradh íseal agus íonacht ann.Má tá an OD600 de thuaslagán baictéarach 0.65, moltar 7.5 ml de Buffer P1 a úsáid nuair a bhaintear as 150 ml de thuaslagán baictéarach;nuair a bhíonn OD600 0.75, ba cheart 8 ml de Mhaoláin P1 a úsáid agus ba cheart méideanna Maoláin P2 agus P4 a athrú dá réir sin.Má mhéadaítear toirt an tuaslagáin baictéarach go 200 ml, moltar anlíon na Maoláin P1, P2, agus P4 a mhéadú go comhréireach.
3. Cuir 7.5 ml de Mhaoláin P2 leis an bhfuaid baictéarach ó chéim 2 agus measc suas agus síos go réidh ar feadh 6 – 8amanna agus gor ag teocht an tseomra ar feadh 4 - 5 nóiméad.
Δ Inbhéartaigh go réidh chun meascadh go críochnúil.Déanfaidh vortexing an ilroinnt DNA genomic, rud a fhágann go mbeidh blúirí DNA genómacha sa plasmid asbhainte.Ag an am seo, éiríonn an tuaslagán slaodach agus tréshoilseach, rud a léiríonn go bhfuil na baictéir lysed go hiomlán.Níor chóir go mbeadh an ré níos mó ná 5 nóiméad chun scrios na plasmids a sheachaint.Mura bhfuil an réiteach soiléir, d'fhéadfadh go mbeadh an iomarca baictéir mar thoradh airlysis neamhiomlán, mar sin ba cheart méid na baictéir a laghdú go cuí.
4. Cuir 7.5 ml de Mhaoláin P4 leis an bhfuaid baictéarach ó chéim 3 agus déan inbhéartú láithreach 6 – 8 n-uaire chun an tuaslagán a chur ar chumas Maolán P2 a neodrú go hiomlán.Ag an am seo, ba chóir go mbeadh deascán flocculent bán le feiceáil.Lártheifneoir ag níos mó ná thart ar 11,000 rpm (12,000 × g) ar feadh 10 - 15 nóiméad, pípeáil go cúramach an comhshnáithín isteach i bhfeadán lártheifneoir bun cruinne nua 50 ml (féinullmhaithe), agus seachainasú an deascán bán ar snámh.
Δ Cuir Maolán P4 leis agus inbhéartaigh láithreach chun meascadh go maith.Fág an feadán chun seasamh go dtí go ndéantar an deascán bán a dháileadh go cothrom ar fud an réitigh chun cosc a chur ar tháirgeadh deascadh áitiúil a d'fhéadfadh tionchar a bheith aige ar neodrú.Mura bhfuil deascán flocculent aonfhoirmeach bán ann roimh an lártheifneoiriú agus nach bhfuil an comhshamhail soiléir tar éis lártheifneoraithe, is féidir an feadán a bheithlártheifneoirithe ar feadh 5 nóiméad eile.
5. Cuir 0. 1 uair an toirte (10% den toirt comhlíonta, thart ar 2.2 ml) de Scavenger Endotoxin leis an snámhán ó chéim 4 agus inbhéartaithe go meascán.Cuir an tuaslagán i ndabhach oighir nó cuir isteach i oighear brúite (nó reoiteoir cuisniúcháin) ar feadh 5 nóiméad go dtí go n-athraíonn an réiteach ó turbid go soiléir agus trédhearcach (nó fósbeagán turbid), agus meascadh arís agus arís eile ó am go chéile.
Δ Tar éis an Scavenger Endotoxin a chur leis an ollnóva, éireoidh an comhshnámh suaite ach beidh anba chóir go n-éireodh súithleach soiléir (nó beagán suaite) tar éis fuarú sa dabhach oighir.
6. Tar éis don fheitheoir a bheith curtha ag teocht an tseomra (> 25 ℃) ar feadh 10 - 15 nóiméad, beidh sé turbid marméaduithe a theocht go teocht an tseomra.Ansin ba chóir an t-olltán a inbhéartú go meascán.
Δ Má tá teocht an tseomra níos ísle nó má tá tú ag iarraidh an t-am eastósctha a laghdú, is féidir an snámhán a ghortú i ndabhach uisce 37 ~ 42 ℃ ar feadh 5 - 10 nóiméad agus is féidir an chéad chéim eile a dhéanamh tar éis an ollnóva.thiocfaidh chun bheith turbid.
7. Lártheifneoir an ollnóva ag thart ar 11,000 rpm (12,000 × g) ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra (caithfidh an teocht a bheith >25 ℃) chun an chéim a scaradh.Tá an DNA sa phas uiscí uachtarach agus tá endotoxin agus eisíontais eile sa chiseal íochtair ghorm olach.Aistrigh anCéim uiscí ina bhfuil DNA chuig feadán nua aguscaith an ciseal olach.
Δ Caithfidh an teocht le linn lártheifneoraithe a bheith os cionn 25 ℃ toisc nach bhfuil scaradh céim éifeachtachtharlaíonn má tá an teocht ró-íseal.
Δ Mura bhfuil an scaradh céim éifeachtach, is féidir an teocht lártheifneoirithe a choigeartú go 30 ℃ agusis féidir am an lártheifneora a mhéadú go 15 min.
Δ Ná tarraing an ciseal gorm olach mar go bhfuil inotoxin agus neamhíonachtaí eile ann.
Meicníocht
Neodrú Lysis Athfhionraí
◇ Cuir 7.5 ml Maolán P1 leis
◇ Cuir 7.5 ml Maolán P2 leis
◇ Cuir 7.5 ml Maolán P4 leis
Deireadh a chur le endotoxin
◇ Cuir 0 leis. 1 uair níos mó toirte an Scavenger Endotoxin
Ceangal agus Níochán
◇ Cuir 0.5 uair an toirt isopropanol leis
◇ Cuir 10 ml Maolán PW leis
◇ Cuir 10 ml Maolán PW leis
Elution
◇ Cuir 1 – 2 ml Maolán TB nó dH2O saor ó Endotoxin leis
