Glycosylase DNA Uracil
Is clón athchuingreach E.coli é Uracil-DNA Glycosylase (UNG nó UDG) le meáchan móilíneach 25 kDa.Catalaíonn sé scaoileadh uracil saor ó DNA aon-shnáithe agus snáithe dúbailte ina bhfuil uracil, agus tá sé neamhghníomhach i gcoinne RNA, agus is féidir é a úsáid chun éilliú táirgí aimplithe PCR a chosc.Tá prionsabal na gníomhaíochta bunaithe ar an bhfíric, má chuirtear dUTP in ionad dTTP san imoibriú PCR agus má dhéantar táirge aimplithe PCR ina bhfuil bunanna du a fhoirmiú, is féidir leis an einsím banna glycosidic bunanna U a bhriseadh go roghnach i snáithe amháin agus snáithe dúbailte. DNA agus díghrádaigh an táirge aimpliúcháin PCR.
Iarratas Molta
Aimpliú Cosc ar Éilliú
Coinníoll Stórála
-20 ° C le haghaidh stórála fadtéarmach, ba chóir é a mheascadh go maith sula n-úsáidfear é, seachain reo-leá go minic.
Maolán stórála
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Cobhsaitheoir, 50% Glicearol.
Sainmhíniú ar an Aonad
Is é 1 aonad an méid einsím a theastaíonn chun 1µg de DNA aonshnáithe ina bhfuil bunanna dU a dhíghrádú in 1 uair ag 37°C.
Rialú Cáilíochta
1.Tá íonacht leictreafóiriteach SDS-PAGE níos mó ná 98%
2.Íogaireacht aimpliúcháin, rialú bhaisc go bhaisc, cobhsaíocht
3.Tar éis 1U de UNG a chóireáil ag 50 ℃ ar feadh 2 nóiméad, ba cheart an teimpléad ina bhfuil U faoi bhun 103 cóip a dhíghrádú go hiomlán agus ní féidir aon táirge aimpliúcháin a tháirgeadh
4.Gan aon ghníomhaíocht nuclease exogenous
Treoracha
| Comhpháirteanna | Toirt (μL) | Tiúchan deiridh |
| Maolán 10 × PCR (dNTP saor in aisce, Mg²+saor) | 5 | 1× |
| dUTPanna (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ionadaigh dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Teimpléad | - | ＜1μg/imoibriú |
| ddH₂O | Go dtí 50 | - |
Nóta: a: Má úsáidtear é le haghaidh qPCR/qRT-PCR, ba cheart an taiscéalaí fluaraiseacha a chur isteach sa chóras imoibrithe.De ghnáth, is féidir le tiúchan primer deiridh de 0.2 μM torthaí maithe a thabhairt;nuair a bhíonn an fheidhmíocht imoibrithe bocht, is féidir an tiúchan primer a choigeartú sa raon 0.2-1 μM.De ghnáth, tá an tiúchan probe optamaithe sa raon 0.1-0.3 μM.Is féidir turgnaimh ar ghrádán comhchruinnithe a dhéanamh chun teacht ar an meascán is fearr de phriméir agus de thaiscéalaí.
Nótaí
1.Is féidir einsím UNG a úsáid chun na táirgí aimplithe dUTP éillithe a bhaint as an gcóras imoibrithe roimh an imoibriú aimplithe PCR, ansin chun torthaí bréagach-dearfacha de bharr éillithe táirge a sheachaint.
2.Is é an teocht is fearr le haghaidh einsím UNG a úsáidfear san imoibriú PCR frith-éillithe go ginearálta 50 ℃ ar feadh 2 nóiméad;is é an coinníoll díghníomhaithe ná 95 ℃ ar feadh 5 nóiméad.
3.Seachain reo-leá go minic, agus ná nocht do luaineachtaí móra teochta.
4.Tá éifeachtacht úsáide difriúil dUTP agus íogaireacht d'einsím UNG ag géinte éagsúla atá le aimpliú, dá bhrí sin, má tá laghdú ar íogaireacht braite mar thoradh ar úsáid an chórais UNG, ba cheart an córas imoibrithe a choigeartú agus a bharrfheabhsú, más gá duit tacaíocht theicniúil, déan teagmháil le do thoil. ár gcomhlacht.
