Trascríobh droim ar ais RTL
Is polaiméaráis DNA RNA-spleách ar theimpléad é RTL transcriptase nach bhfuil an ghníomhaíocht exonuclease 3'→5' ann agus a bhfuil gníomhaíocht RNase H aige.Is féidir leis an einsím seo RNA a úsáid mar theimpléad chun snáithe comhlántach DNA a shintéisiú, ar féidir é a chur i bhfeidhm ar shintéis cDNA den chéad snáithe, go háirithe le haghaidh RT-LAMP (aimpliú isiteirmeach trí mheán lúb).I gcomparáid le RTL droim ar ais transcriptase 1.0, tá an íogaireacht feabhsaithe go mór, tá an cobhsaíocht theirmeach níos láidre, agus tá an t-imoibriú ag 65 ° C níos cobhsaí.Is féidir transcriptase droim ar ais RTL (saor ó ghliocról) a úsáid chun ullmhóidí lyophilized, imoibrithe RT-LAMP lyophilized etc.
Sainmhíniú ar an Aonad
Ionchorpraítear 1 nmol de dTTP in aonad amháin in ábhar intuaslagtha in aigéad i 20 nóiméad ag 50°C ag baint úsáide as poly(A)•oligo(dT)25 mar theimpléad-primer.
Comhpháirteanna
| Comhpháirt | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Trascríobh droim ar ais RTL (saor ó ghliocról) (15U/μL) | 0.1 mL | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL Maolán | 1.5 mL | 4 × 1.5 mL | 5×10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 mL | 2 × 1.5 mL | 3×10 mL |
Coinníoll Stórála
Iompar faoi 0 ° C agus a stóráil ag -25 ° C ~ -15 ° C.
Rialú Cáilíochta
- Gníomhaíocht Iarmhar naEnúicléas:Léiríonn imoibriú 50 μL ina bhfuil 1 μg de λDNA agus 15 aonad de RTL2.0 gortha ar feadh 16 uair an chloig ag 37 ℃ patrún céanna le rialú diúltach ag leictreafóiréis glóthach.
- Gníomhaíocht Iarmhar naExonuclease:Léiríonn imoibriú 50 μL ina bhfuil 1 μg de λDNA díleáite Hind Ⅲ agus 15 aonad de RTL2.0 gortha ar feadh 16 uair an chloig ag 37 ℃ patrún céanna le rialú diúltach ag leictreafóiréis glóthach.
- Gníomhaíocht Iarmhar naNicáis:Léiríonn imoibriú 50 μL ina bhfuil 1 μg de pBR322 sárchoiled agus 15 aonad de RTL2.0 gortha ar feadh 4 huaire ag 37°C an patrún céanna le rialú diúltach trí leictreafóiréis glóthach.
- Gníomhaíocht Iarmhar naRNase:Léiríonn imoibriú 10 μL ina bhfuil 0.48 μg de MS2 RNA agus 15 aonad de RTL2.0 gortha ar feadh 4 huaire ag 37°C an patrún céanna le rialú diúltach ag leictreafóiréis glóthach.
- E. coli gDNA:Tomhaistear leE.colifeisteáin braite HCD ar leith, tá níos lú ná 1 aonad RTL2.0 i 15 aonadE. coligéanóm.
Socrú Imoibrithe
Prótacal Sintéise cDNA
| Comhpháirteanna | Toirt |
| Teimpléad RNA a | roghnach |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) nó meascán Random Primer(60uM) | 2 μL |
| Meascán dNTP (10mM an ceann) | 1 μL |
| Coscóir RNase (40U/uL) | 0.5 μL |
| Trascríobh droim ar ais RTL 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL Maolán | 2 μL |
| Uisce saor ó Núicléas | Suas le 20 μL |
Nótaí:
1) Is é an dáileog molta de Iomlán RNA ná 1ng ~ 1μg
2) Ba é an dáileog molta mRNA ná 50ng~100ng
teirmeafosfáití-rothaíocht Coinníollacha maidir le gnáthamh imoibriú:
| Teocht (°C) | Am |
| 25 °Ca | 5 nóiméad |
| 55 °C | 10 nóiméadb |
| 80 °C | 10 nóiméad |
Nótaí:
1) Má úsáidtear Meascán Randamach Primer, céim ghoir ag 25°C.
2) Má úsáidtear meascán sprice primer, céim ghoir ag 55 ° C ar feadh 10 ~ 30 nóiméad.
Prótacal RT-LAMP
| Comhpháirteanna | Toirt | Tiúchan Deiridh |
| Teimpléad RNA | roghnach | ≥10 cóip |
| Meascán dNTP (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mM |
| Primers FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| Primers F3/B3 (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| Primers LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| Coscóir RNase (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Frithghníomh |
| Trascríobh droim ar ais RTL 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/Frithghníomh |
| Polaiméiráis DNA Bst V2 (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Frithghníomh |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (Iomlán 8 mM) |
| Maolán 10×HC RTL (nó Maolán 10×HC Bst V2) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Uisce saor ó Núicléas | Suas le 25 μL | - |
Nótaí:
1) Measc trí vortexing agus lártheifneoir go hachomair le bailiú.Goir teochta seasta ag 65°C ar feadh 1 uair.
2) Tá an dá mhaolán idir-inoibritheach agus tá an comhdhéanamh céanna acu.
Nótaí
1. Cruthóidh an táirge seo solad bán nuair a stórálfar ag -20 °C é.Tóg amach ó -20°C é agus cuir ar oighear é ar feadh thart ar 10 nóiméad.Tar éis leá, is féidir é a úsáid trí chroitheadh agus a mheascadh.
2.D'fhéadfaí an táirge cDNA a stóráil ag -20°C nó -80°C nó é a úsáid láithreach le haghaidh imoibriú PCR.
3. Chun éilliú RNase a chosc, coinnigh an limistéar turgnamhach glan, agus caith lámhainní glan agus maisc le linn oibriú.
