Gléasra Kit PCR díreach
Cat Uimh: HCR2020A
Tá Kit PCR Direct Plant oiriúnach le haghaidh aimpliú díreach ar dhuilleoga plandaí, síolta, etc., agus is féidir é a úsáid le haghaidh scagadh ard-tréchur ar shamplaí plandaí nach bhfuil polaisiúicrídí agus polyphenols iontu.Tá lamháltas níos fearr ag an aimpliú díreach DNA polymerase atá bunaithe ar an éabhlóid faoi stiúir ar choscóirí PCR i bplandaí.Idir an dá linn, coinníonn sé an fheidhmíocht aimplithe ard, atá oiriúnach le haghaidh aimpliú blúirí DNA laistigh de 5 kb.Is féidir maolán uathúil Lysis A sa trealamh a úsáid chun fíocháin plandaí úra nó reoite a liseadh.Tá sé éasca a oibriú agus is féidir an lysate a úsáid mar theimpléad le haghaidh aimpliú gan íonú.Tá oibreáin chosanta sa chóras a chuireann ar chumas samplaí amh a mhéadú go héifeachtach tar éis reo agus leá arís agus arís eile.Ní gá 2 × Gléasra Direct Master Mix ach primers agus teimpléid a chur leis chun imoibriú aimpliúcháin a dhéanamh, rud a laghdóidh oibríochtaí píbéireachta agus feabhas a chur ar thréchur braite agus in-atáirgtheacht na dtorthaí.
Comhpháirteanna
| Comhpháirteanna | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Gléasra Meascán Máistir Díreach | 1.25 ml | 4×1.25 ml |
| Maolán Lysis Díreach Gléasra A | 5 ml | 20 ml |
| Maolán Lysis Gléasra Díreach B* | 5 ml | 20 ml |
*Is imoibrí roghnach é Maolán Plandaí Díreach Lysis B, a úsáidtear chun Maolán Lysis A Gléasra Díreach a neodrú chun am stórála samplaí a fhadú.Is féidir é a úsáid de réir an staid iarbhír.
Coinníollacha Stórála
2 × Gléasra Meascán Díreach Máistir, stóráil ag -30 ~ -15 ℃ agus a sheachaint reo agus leá arís agus arís eile;Gléasra Maolán Lysis Díreach, stóráil ag -30 ~ -15 ℃ nó 2 ~ 8 ℃.
Próiseas Turgnaimh
Próiseáil Samplach–Duilleog Plandaí
Modh díreach:Moltar duilleoga óga a úsáid.Bain úsáid as punch poll le trastomhas seasta de 0.5 - 3 mm chun sampláil beag aonfhoirmeach a fháil, agus ansin cuir an sampla go díreach chuig an gcóras PCR (moltar córas 50 μl).Tabhair faoi deara, déan cinnte go bhfuil an sampla sa réiteach PCR agus ní i gcoinne bhalla an fheadáin.Má úsáidtear PCR díreach chun blúirí fada agus samplaí casta a mhéadú, trí shampla le trastomhas níos lú (0.5 – 1 mm) a úsáid mar theimpléad is féidir cabhrú le torthaí níos fearr a fháil.
Modh lysis meilt:Moltar duilleoga óga a úsáid.Glac píosa beag duille (thart ar 1 - 3 mm ar trastomhas), cuir é i 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, agus meileann sé oiread agus is féidir (is féidir an chéim seo a dhéanamh tríd an duilleog a bhrú le tip pípéad 100 μl. chun an sampla a mhaisigh).Má úsáidtear méideanna níos mó d'fhíocháin duille (ná níos mó ná 7 mm), méadaigh méid an mhaoláin caolaithe go 50 μl.Tar éis na duilleoga a bheith ina talamh, ba chóir go mbeadh an réiteach le feiceáil glas.Tar éis lártheifneoiriú gairid, cuir 1 µl den shárdhuine leis an gcóras PCR mar theimpléad imoibrithe .
Modh lysis teirmeach:Moltar duilleoga óga a úsáid.Glac píosa beag duille (thart ar 1 - 3 mm ar trastomhas), cuir i 20 µl Maolán Gléasra Díreach A Lysis A, agus teas é ag 95 ° C ar feadh 5 - 10 nóiméad.Is féidir an t-am lysis a shíneadh go cuí le haghaidh duilleoga atá deacair a lyse (gan níos mó ná 20 min).Má úsáidtear méideanna níos mó d'fhíocháin duille (ná níos mó ná 7 mm), méadaigh méid an mhaoláin caolaithe go 50 μl.Tar éis téamh, lártheifneoir go hachomair, agus cuir 1 μl de shárnáisiúnta leis an gcóras PCR mar theimpléad imoibriúcháin.
Próiseáil Samplach-Síol Plandaí
Modh lysis meilt:Bain úsáid as scalpel chun síolta a ghearradh le trastomhas de 5 mm, cuir iad go 100 μl de Mhaoláin Plandaí Díreach Lysis A, agus meileann an sampla le tip pípéad nó uirlisí eile.Vortex go hachomair agus lig seasamh ag teocht an tseomra ar feadh 3 - 5 nóiméad.Déan cinnte go bhfuil an sampla síolta báite sa mhaolán caolúcháin.Tar éis lártheifneoiriú gairid, cuir 1 μl den shástán leis an gcóras PCR mar theimpléad imoibrithe.
Modh lysis teirmeach:Bain úsáid as scalpel chun síolta a ghearradh le trastomhas 5 mm, cuir iad le 100 μl de Mhaoláin Lusaí A Gléasra Díreach A, agus teas ag 95 ° C ar feadh 5 - 10 nóiméad.Is féidir an t-am lysis a shíneadh go cuí le haghaidh duilleoga atá deacair a lyse (gan níos mó ná 30 min).Tar éis téamh, lártheifneoir go hachomair, agus cuir 1 μl comhshnaidhm leis an gcóras PCR mar templateb imoibriúcháin.
a.Is féidir siosúr nó uirlisí eile a úsáid freisin chun samplaí de mhéid oiriúnach a ghearradh;má athúsáidtear an punch nó an siosúr, ba chóir iad a ghlanadh le tuaslagán fochlóiríte sóidiam 2% roimh gach úsáid chun tras-éilliú a chosc idir samplaí.
b.Bí cinnte go bhfuil an Maolán Lysis Díreach Gléasra leáite go hiomlán roimh úsáid.Má tá an maolán slaodach nó má tá deascán aige, is féidir é a théamh ag 37 ℃ chun é a leá go hiomlán roimh úsáid.
c.Is féidir méid an teimpléid sa chóras imoibrithe a choigeartú go cuí de réir na difríochta i méid ábhar plandaí agus caolaitheoir a chuirtear leis.
Gléasra Maolán Lysis Díreach
Tá an Maolán Plandaí Díreach Lysis A atá sa táirge seo optamaithe go docht chun genome fhormhór na bhfíochán plandaí a scaoileadh agus tá sé oiriúnach le haghaidh stórála gearrthéarmach de phlandaí creimeacha ag 4 ℃.Más gá an sampla a stóráil ar feadh tréimhse níos faide ama (m.sh., 1 - 2 mhí), moltar an súthaire a aistriú chuig feadán EP nua agus é a stóráil ag -20 ℃.Chun na samplaí a stóráil ar bhealach níos cobhsaí, cuir an toirt chéanna de Mhaoláin Luis Dhíreach B leis an bhfostán aistrithe, measc go maith agus stóráil ag -20 ℃.Athraíonn an t-am stórála cobhsaí de réir samplaí plandaí agus stáit.
Córas Imoibrithe
| ddH2O | Go 20.0 µl | Go 50.0 µl |
| 2 × Gléasra Meascán Máistir Díreacha | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Sampla duille planda/sliocht amh(Féach ar Phróiseáil Samplach) | Diosca duille 0.5 – 3 mm/x µl | Diosca duille 0.5 – 3 mm/x µl |
a.Tá Mg2+ag tiúchan deiridh de 2 mM.
b.Moltar tiúchan deiridh de 0.4μM a úsáid le haghaidh gach primer.Beidh aimpliú neamhshonrach méadaithe mar thoradh ar ró-úsáid a bhaint as primers.
c.Is féidir an méid sampla a úsáidtear a choigeartú de réir an staid iarbhír.Is féidir an méid a úsáidtear in imoibriú aonair de shampla amh-lísithe a choigeartú idir 2% – 20% de thoirt iomlán an imoibrithe.Má úsáidtear an iomarca samplaí is féidir teip aimpliúcháin a chur faoi deara.
Clár Frithghníomh
| Céimeanna | Teocht | Am |
| Dínádúrú Tosaigh | 98 ℃ | 5 nóim |
| Dínádúrú | 95 ℃ | 10 soic |
| Annealing | 58 ~ 72 ℃ | 15 soic |
| Síneadh | 72 ℃ | 30 soic |
| Síneadh Deiridh | 72 ℃ | 5 nóim |
a.Cuireann Dínádúrú Tosaigh (98 ℃, 5 nóim) chun cinn lysis fíocháin plandaí, ag scaoileadh DNA genomic is féidir a úsáid le haghaidh aimpliú PCR.Ná giorraigh an t-am nó laghdaigh an teocht.
b.Moltar é a shocrú comhionann leis an luach primer Tm nó 2 ~ 4 ℃ níos airde ná an luach Tm.Tá an t-aimpliú díreach DNA polymerase a úsáidtear sa táirge seo difriúil ó traidisiúnta Taq DNA polymerase, agus tá ceanglais speisialta maidir le teocht anáil imoibriúcháin ； úsáid teocht ard annealing is féidir a laghdú go héifeachtach aimpliú nonspecific agus feabhas a chur ar an éifeachtacht aimplithe.I gcás teimpléid casta, is féidir an t-aimpliú éifeachtach a bhaint amach trí theocht anáil a choigeartú agus an t-am síneadh a shíneadh.
c.Más é ≤1 kb fad an táirge aimpliúcháin, socraítear an t-am síneadh ag 30 sec/kb;má tá fad an táirge aimpliúcháin > 1 kb, socraítear an t-am sínte ag 60 sec/kb.
d.I gcás samplaí casta nó samplaí le toradh íseal aimpliúcháin, is féidir líon na dtimthriallta a mhéadú go cuí go 40 -50 timthriall.
Feidhmchláir
Tá sé infheidhme maidir le fíocháin phlandaí a aimpliú go díreach agus scagadh ard-tréchur a dhéanamh ar shamplaí plandaí nach bhfuil polaisiúicrídí agus polyphenols iontu.
Nótaí
Le húsáid taighde amháin.Níl sé le húsáid i nósanna imeachta diagnóiseacha.
1. Maidir le aimpliú plandaí amh nó aimpliú díreach, moltar DNA géanóm íonaithe a úsáid mar rialú dearfach sula dtosaíonn tú ar an turgnamh chun a chinntiú go bhfuil an córas, na primers agus na hoibríochtaí ceart.
2. Tá gníomhaíocht láidir profléitheoireachta ag an aimpliú díreach DNA polymerase a úsáidtear sa trealamh seo.Más gá clónáil TA a dhéanamh, moltar an DNA a íonú sula gcuirtear an adenín leis.
3. Treoir Dearadh Primer:
a.Moltar gur G nó C a bheadh sa bhonn deireanach ag deireadh 3′ an phriméir.
b.Ba cheart neamhréireanna comhleanúnacha a sheachaint sna 8 mbonn dheireanacha ag deireadh 3′ an primer.c.Seachain struchtúir hairpin ag deireadh 3′ an primer.
d.Níor cheart go mbeadh na difríochtaí i luach Tm an primer ar aghaidh agus an primer droim ar ais níos mó ná 1 ℃ agus ba cheart an luach Tm a choigeartú go 60 ~ 72 ℃ (moltar Primer Premier 5 chun an luach Tm a ríomh).
e.Níor cheart seichimh primer breise nach bhfuil comhoiriúnach leis an teimpléad a chur san áireamh agus an luach primer Tm á ríomh.
f.Moltar ábhar GC an primer a bheith 40% -60%.
g.Ba cheart go mbeadh an dáileadh foriomlán A, G, C agus T sa primer chomh cothrom agus is féidir.Seachain úsáid a bhaint as réigiúin a bhfuil ard-ábhar GC nó AT iontu.
h.Seachain seichimh chomhlántacha de 5 bhonn nó níos mó a bheith i láthair laistigh den primer nó idir dhá phriméir agus seachain seichimh chomhlántacha de 3 bhonn nó níos mó ag deireadh 3′ dhá phriméir.
i.Bain úsáid as feidhm NCBI BLAST chun sainiúlacht an primer a sheiceáil chun aimpliú neamhshonrach a chosc.
