Einsím Uasteorannú Víreas Vaccinia
Díorthaítear einsím caipínithe víreas Vaccinia ó phéine athchuingreach E. coli a iompraíonn na géinte don einsím uasteorannú Vaccinia.Tá an einsím aonair seo comhdhéanta de dhá fho-aonad (D1 agus D12) agus tá trí ghníomhaíocht einsímeacha (RNA triphosphatase agus guanylyltransferase ag an bhfo-aonad D1 agus guanine methyltransferase ag an bhfo-aonad D12).Víreas Vaccinia Tá Einsím Caping éifeachtach chun foirmiú struchtúr caipín a chatalú, ar féidir leis an struchtúr caipín 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) a cheangal go sonrach le deireadh 5′ RNA.Tá ról tábhachtach ag struchtúr caipín (Cap 0) i gcobhsú mRNA, iompar agus aistriúchán in eukaryotes.Is modh éifeachtach simplí é RNA a theorannú trí imoibriú einsímeach ar féidir feabhas suntasach a chur ar chobhsaíocht agus ar aistriúchán RNA le haghaidh trascríobh in vitro, aistriú agus micrinstealladh.
Comhpháirteanna
Einsím Uasteorannú Víreas Vaccinia (10 U/μL)
10 × Maolán uasteorannú
Coinníollacha stórála
-25～- 15 ℃ le haghaidh stórála （ Seachain timthriallta reo-leá arís agus arís eile）
Maolán stórála
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. EDTA 1mM, 0. 1% Triton X- 100, 50% gliocról.
Sainmhíniú ar an Aonad
Sainmhínítear aonad amháin d’Einsím Caping víreas Vaccinia mar an méid einsím a theastaíonn chun 10pmol de GTP a ionchorprú i dtras-scríbhinn 80nt in 1 uair ag 37°C.
Rialú Cáilíochta
Exonuclease:Ní thugann 10U de Einsím Caping víreas Vaccinia le 1μg λ-Hind III díleá DNA ag 37 ℃ ar feadh 16 uair an chloig aon díghrádú mar a chinntear le leictreafóiréis glóthach agarose.
Endonuclease:Ní thugann 10U d'Einsím Caping víreas Vaccinia le 1μg λDNA ag 37 ℃ ar feadh 16 uair an chloig aon díghrádú mar a chinntear le leictreafóiréis glóthach agarose.
Nicáis:Ní thugann 10U d'Einsím Capping víreas Vaccinia le 1 μg pBR322 ag 37 ℃ ar feadh 16 uair an chloig aon díghrádú mar a chinntear le leictreafóiréis glóthach agarose.
RNase:Ní thugann 10U d’Einsím Caping víreas Vaccinia le 1.6μg MS2 RNA ar feadh 4 uair an chloig ag 37 ℃ aon díghrádú mar a chinntear le leictreafóiréis glóthach agarose.
1.DNA coli:10U de Víreas Vaccinia Déantar einsím uasteorannaithe a scagadh le haghaidh DNA géanómaíochta E. coli a bheith i láthair trí úsáid a bhaint as TaqMan qPCR le primers a bhaineann go sonrach leis an lócas rRNA E. coli 16S.Is é an éilliú DNA géanóm E. coli ná≤1 E. coli genome.
2.Baictéarach Endotoxin: LAL-test, de réir eagrán na Síne Pharmacopoeia IV 2020, modh tástála teorainn glóthach, riail ghinearálta (1143).Ba cheart go mbeadh ábhar endotoxin baictéarach ≤10 EU/mg.
Córas imoibrithe agus coinníollacha
1. Prótacal Capping (toirt an imoibrithe: 20 μL)
Tá an nós imeachta seo infheidhme maidir leis an imoibriú caipínithe de 10μg RNA (≥100 nt) agus is féidir é a scála suas de réir éilimh thurgnamhach.
I) Comhcheangail 10μg RNA agus H2O saor ó Núicléas i bhfeadán micreafuge 1.5 ml go dtí toirt deiridh 15.0 µL.*10 × Maolán Uasteorannaithe: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8.0)
2) Teas ag 65 ℃ ar feadh 5 nóiméad agus folctha oighir ina dhiaidh sin ar feadh 5 nóiméad.
3) Cuir na comhpháirteanna seo a leanas leis san ord sonraithe
| Coponent | Volume |
| RNA dínádúraithe (≤10μg, fad≥100 nt) | 15 μL |
| 10×Capping Maolán* | 2 μL |
| GTP (10 mM) | 1 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| Einsím Uasteorannú víreas Vaccinia (10U/μL) | 1 μL |
*10 × Maolán uasteorannú: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)
4) Gor ag 37°C ar feadh 30 nóiméad, tá RNA teorannaithe anois agus réidh le haghaidh feidhmchláir iartheachtacha.
2. teirminéal 5′ imoibriú lipéadaithe (toirt an imoibrithe: 20 μL)
Tá an prótacal seo deartha chun lipéad a chur ar RNA ina bhfuil trífhosfáit 5’ agus is féidir é a mhéadú de réir an éilimh.Beidh tionchar ag an gcóimheas molar de RNA: GTP, chomh maith leis an ábhar GTP i samplaí RNA, ar éifeachtúlacht corpraithe lipéid.
1) Comhcheangail an méid cuí RNA agus H2O saor ó Núicléas i bhfeadán micrfhiús 1.5 ml go dtí toirt deiridh 14.0 µL.
2) Teas ag 65 ℃ ar feadh 5 nóiméad agus folctha oighir ina dhiaidh sin ar feadh 5 nóiméad.
3) Cuir na comhpháirteanna seo a leanas leis san ord sonraithe.
| Coponent | Volume |
| RNA dínádúraithe | 14 μL |
| 10 × Maolán uasteorannú | 2 μL |
| Meascán GTP** | 2 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| Einsím Uasteorannú víreas Vaccinia (10U/μL) | 1 μL |
** Tagraíonn GTP MIX do GTP agus do líon beag marcóirí.Le haghaidh tiúchan GTP, féachgo Nóta 3 .
4) Gor ag 37°C ar feadh 30 nóiméad, tá deireadh RNA 5′ lipéadaithe anois agus réidh le haghaidh srutha
Feidhmchláir
1. MRNA a theorannú roimh thástálacha aistriúcháin/aistriúchán in vitro
2. 5´ deireadh mRNA a lipéadú
Nótaí ar úsáid
1.Má dhéantar tuaslagán RNA a théamh roimh gor leis an Einsím Capping Vaccinia, baintear an struchtúr tánaisteach ar 5’deireadh na tras-scríbhinne.Síneadh an t-am go 60 nóiméad le haghaidh tras-scríbhinní a bhfuil 5 chríoch ard-struchtúrtha aitheanta acu.
2. Ba chóir RNA a úsáidtear le haghaidh imoibrithe caipínithe a íonú roimh é a úsáid agus a chrochadh in uisce saor ó núicléas.Níor cheart go mbeadh EDTA i láthair agus ba cheart go mbeadh an tuaslagán saor ó shalainn.
3. Chun an foirceann 5´ a lipéadú, ba chóir go mbeadh an tiúchan GTP iomlán thart ar 1-3 huaire níos mó ná tiúchan molar mRNA san imoibriú.
4. Is féidir méid an chórais imoibrithe a scála suas nó síos de réir an iarbhír.
