mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase díorthaithe ó phanna E. coli athchuingreach a iompraíonn an ghéin don vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.Cuireann an einsím seo grúpa meitile ag suíomh 2´-O den chéad núicléitíd in aice leis an struchtúr caipín ag deireadh 5 den RNA. Úsáideann an einsím S-adenosylmethionine (SAM) mar dheontóir meitile chun RNA caipínithe meitioláitithe -0) struchtúr caipín-1 mar thoradh air.
Is féidir le struchtúr Cap1 an éifeachtúlacht aistriúcháin a mhéadú, feabhas a chur ar léiriú mRNA i dturgnaimh aistrithe agus microinstealladh. Éilíonn an einsím seo go sonrach RNA le caipín m7GpppN mar fhoshraith.Ní féidir leis RNA a úsáid le pN, ppN, pppN nó GpppN ag an deireadh 5´.Is féidir RNA caipínithe a ullmhú trí thrascríobh in vitro ag baint úsáide as analóg caipín nó trí uasteorannú einsímeach ag baint úsáide as an Einsím Caping Vaccinia.
Comhpháirteanna
mRNA caipín 2'-O-Methyltransferase (50U/μL)
10 × Maolán Imoibrithe Uasteorannú
Stóráil
-25 ～- 15 ℃ le haghaidh stórála （ Seachain timthriallta reo-leá arís agus arís eile）
Maolán stórála
20 mM Tris-HCl (pH 8.0，25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% gliocról.
Sainmhíniú aonaid
Sainmhínítear aonad amháin mar an méid einsím a theastaíonn chun 10 pmóil de 80 nt tras-scríbhinn RNA caipínithe a mheitiliú in 1 uair ag 37°C.
Measúnachtaí rialaithe cáilíochta
Exonuclease:50U de mRNA Cap 2 ' -O-Methyltransferase le 1μg λ-Hind III díolama DNA ag 37 ℃ ar feadh 16 uair an chloig aon díghrádú mar a chinntear ag leictreafóiréis glóthach agarose.
Endonuclease: 50 U de mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase le 1 μg λDNA ag 37 ℃ ar feadh 16 uair an chloig níl aon díghrádú mar a chinntear le leictreafóiréis glóthach agarose.
Nicáis: 50U de mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase le 1μg pBR322 ag 37 ℃ ar feadh 16 uair an chloig níl aon díghrádú mar a chinntear le leictreafóiréis glóthach agarose.
RNase: 50U de mRNA Cap 2 ' -O-Methyltransferase le 1.6μg MS2 RNA ar feadh 4 uair an chloig ag 37 ℃ táirgeacht aon díghrádú mar a chinnfidh leictreafóiréis glóthach agarose.
E. coli DNA: 50U de mRNA Déantar caipín 2 ´ -O-Methyltransferase a scagadh le haghaidh láithreachtE. coli DNA genomic ag baint úsáide as TaqMan qPCR le primers ar leith do naE. coli 16S lócas rRNA.Tá anE. coli Is é éilliú DNA géanóm = 1E. coli géanóm.
Baictéarach Endotoxin: LAL-tástáil, de réir eagrán na Síne Pharmacopoeia IV 2020, modh tástála teorainn glóthach, riail ghinearálta (1143).Ba cheart go mbeadh an cion baictéarach endotoxin = 10 EU/mg.
Córas imoibrithe agus coinníollacha
1. Comhcheangail méid iomchuí RNA Capped agus H2O saor ó RNase i bhfeadán micreafuge 1.5 mL go dtí toirt deiridh 16.0 µL.
2. Teas ag 65 ℃ ar feadh 5 nóiméad agus oighir folctha ina dhiaidh sin ar feadh 5 nóiméad.
3. Cuir na comhpháirteanna seo a leanas leis san ord sonraithe (do mheitiliú RNA Capped
níos lú ná 10
| Comhpháirt | Toirt |
| RNA dínádúraithe caipínithe | 16 μL |
| Maolán Imoibrithe Uasteorannaithe 10X* | 2 μL |
| SAM (4 mM) | 1 μL |
| caipín mRNA 2’-O-Methyltransferase (50 U/μL) | 1 μL |
| ddH2O | Go 20 μL |
* 10 × Maolán Imoibríochta Caping: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. Goir ag 37 ℃ ar feadh 1 uair an chloig (moltar 2 uair goir don spriocbhlúire níos lú ná 200 nt).
Feidhmchláir
Feabhas a chur ar léiriú mRNA le linn turgnaimh microinstealladh agus aistrithe.
Nótaí ar úsáid
1. Roimh imoibriú, ba chóir RNA a íonú agus a thuaslagadh in uisce saor ó núicléas, níor cheart go mbeadh aon EDTA agus iain sna réitigh go léir.
2. Moltar an RNA samplach a théamh ag 65 ℃ ar feadh 5 nóiméad roimh an imoibriú chun an struchtúr tánaisteach ar 5'deireadh an tras-scríbhinn a bhaint.D'fhéadfaí é a leathnú go 10 nóiméad le haghaidh struchtúr casta 5 ′ - críochfoirt.
