Kit ELISA RNA dháshnáithe (dsRNA).

Is éard atá sa trealamh seo ná Measúnacht Imdhíon-Iomdhíonta Nasctha Einsím (ELISA) cúplála le córas biotin-Streptavidin, chun dsRNA a thomhas go cainníochtúil le fad os cionn 60 bunphéire (bp), beag beann ar an seicheamh.Tá an pláta réamh-brataithe le antasubstaint frith-dsRNA.cuirtear dsRNA atá sa sampla leis agus ceanglaítear é d’antasubstaintí atá brataithe ar na toibreacha.Agus ansin cuirtear antashubstaint frith-dsRNA biotinylated leis agus ceanglaítear é le dsRNA sa sampla.Tar éis níocháin, cuirtear HRP-Streptavidin leis agus ceanglaíonn sé leis an antasubstaint frith-dsRNA Biotinylated.Tar éis goir nite HRP-Streptavidin neamhcheangailte.Ansin cuirtear réiteach tsubstráit TMB leis agus déanann HRP é a chatalú chun táirge dath gorm a tháirgeadh a d'athraigh go buí tar éis tuaslagán stad aigéadach a chur leis.Tá dlús buí comhréireach leis an méid sprice dsRNA a gabhadh sa phláta.Déantar an t-ionsúcht a thomhas ag 450 nm.

Iarratas

Tá an trealamh seo le haghaidh tomhas cainníochtúil dsRNA iarmharach.

Comhpháirteanna Kit

Stóráil agus Cobhsaíocht

1. Do threalamh neamhúsáidte: D'fhéadfaí an trealamh iomlán a stóráil ag 2 ~ 8 ℃ sa seilfré.Ba cheart solas láidir a sheachaint le haghaidh cobhsaíochta stórála.

2. Maidir le trealamh a úsáidtear: Nuair a bheidh an microplate oscailte, clúdaigh le do thoil toibreacha neamhúsáidte le séalaithe pláta agus filleadh ar an pouch scragall ina bhfuil an paca desiccant, zip-séala an pouch scragall agus filleadh ar 2~8 ℃ chomh luath agus is féidir tar éis é a úsáid.Ba cheart imoibrithe eile a chur ar ais go 2 ~ 8 ℃ chomh luath agus is féidir tar éis iad a úsáid.

Ábhair ag Teastáil Ach Gan Soláthar

1. Léitheoir microplate le scagaire 450 ± 10nm (is fearr más féidir é a bhrath ag tonnfhad 450 agus 650 nm).

2. Croiteoir microplate.

3. Leideanna saor ó RNase agus feadáin lártheifneora.

Sreabhchairt Oibríochta

Sula dTosaíonn Tú

1. Tabhair na comhpháirteanna agus na samplaí trealamh go léir chuig teocht an tseomra (18-25 ℃) sula n-úsáidfear é.Mura n-úsáidfear an trealamh in aon am amháin, le do thoil, bain amach stiallacha agus imoibrithe don turgnamh reatha, agus fág na stiallacha agus na himoibrithe atá fágtha sa riocht riachtanach.

2. Maolán níocháin: caolaigh 40mL de 20 × maolán níocháin tiubhaithe le 760mL d'uisce dí-ianaithe nó driogtha chun 800mL de mhaolán níocháin 1 × a ullmhú.

3. Caighdeán: casadh nó lártheifneoiriú gairid ar an réiteach stoc roimh úsáid.Is é an tiúchan de cheithre chaighdeán a sholáthraítear ná 5ng/μL.Maidir le caighdeáin UTP agus pUTP dsRNA, caolaigh an réiteach stoic go 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL le maolán STE chun an cuar caighdeánach a tharraingt.Maidir le caighdeáin N1-Me-pUTP dsRNA, caolaigh an réiteach stoic go 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL le maolán STE chun an cuar caighdeánach a tharraingt.Le haghaidh caighdeán dsRNA 5-OMe-UTP, caolaigh an réiteach stoic go 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL le maolán STE chun an cuar caighdeánach a tharraingt.Molaimid gur féidir caighdeáin a chaolú mar na cairteacha seo a leanas:

4. Antashubstaint braite biotinylated agus réiteach oibre HRP-streptavidin: casadh nó lártheifneoiriú gairid ar an réiteach stoic roimh úsáid.Caolaigh iad go dtí an tiúchan oibre le maolán caolaithe.

5. Fostáit TMB: asúigh dáileog riachtanach an tuaslagáin le leideanna steiriliú agus ná dumpáil an tuaslagán iarmharach isteach sa vial arís.Tá foshraith TMB íogair don solas, ná nocht an tsubstráit TMB don solas ar feadh i bhfad.

Ag baint úsáide as prótacal

1. Aimsigh líon na stiallacha a theastaíonn don mheasúnacht.Cuir na stiallacha isteach sna frámaí le húsáid.Ba chóir na stiallacha pláta atá fágtha nach n-úsáidtear sa mheasúnacht seo a athphacáil sa mhála le triseoir.Dún an mála go docht le haghaidh stórála cuisnithe.

2. Cuir 100μL gach ceann de na caoluithe de chaighdeán, bán agus samplaí isteach sna toibreacha cuí.Clúdaigh leis an séalaithe pláta.Goir ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra agus croitheadh ​​ag 500rpm.Ba cheart na samplaí a chaolú le maolán STE go dtí an tiúchan cuí le haghaidh measúnacht chruinn.

3. Céim níocháin: Asúigh an réiteach agus nigh le maolán níocháin 250μL chuig gach tobar agus lig dó seasamh ar feadh 30s.Caith an maolán níocháin go hiomlán tríd an pláta a bhrú ar pháipéar ionsúiteach.Go hiomlán nigh 4 huaire.

4. Cuir 100μL de thuaslagán oibre antashubstaint braite biotinylated isteach i ngach tobar.Clúdaigh leis an séalaithe pláta.Goir ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra agus croitheadh ​​ag 500rpm.

5. Déan an chéim níocháin arís.

6. Cuir 100μL de thuaslagán oibre HRP-streptavidin isteach i ngach tobar.Clúdaigh leis an séalaithe pláta.Goir ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra agus croitheadh ​​ag 500 rpm.

7. Déan an chéim níocháin arís.

8. Cuir 100μL de thuaslagán tsubstráit TMB isteach i ngach tobar.Clúdaigh leis an séalaithe pláta.Gor ar feadh 30 nóiméad ag RT Cosain ón solas.Casfaidh an leacht gorm trí thuaslagán tsubstráit a chur leis.

9. Cuir 50 μL de thuaslagán stad isteach i ngach tobar.Casfaidh an leacht buí trí thuaslagán stad a chur leis.Ansin rith an léitheoir microplate agus déan tomhas ag 450nm láithreach.

Torthaí a Ríomh

1. Meán na léamha dúblacha do gach caighdeán, rialú, agus samplaí agus dealaigh an meán-nialais dlús optúil caighdeánach.Tóg cuar caighdeánach le hionsúcht ar an ais ingearach(Y) agus tiúchan dsRNA ar an ais chothrománach (X）.

2. Moltar an ríomh a dhéanamh le bogearraí ríomhaireachta atá bunaithe ar chuar, mar shaineolaí cuar 1.3 nó ELISA Calc i múnla oiriúnach neamhlíneach de 5 nó 4 paraiméadar.

Feidhmíocht

1. Íogaireacht:

teorainn braite níos ísle: ≤ 0.001pg/μL (do UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (do 5-OMe-UTP-dsRNA).

teorainn chainníochtú níos ísle: 0.0156 pg/μL (do UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg/μL (do N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (do 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Beachtas: CV Intra-Measúnú ≤10%, CV de Idir-Mheasúnacht ≤10%

3. Aisghabháil:80%~120%

4.Llíneacht: 0.0156-0.5pg/μL (do UTP-,pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg/μL (do N1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg/μL (do 5-OME-UTP-dsRNA).

Breithnithe

1. Tá teocht agus am imoibrithe TMB ríthábhachtach, déan iad a rialú go docht de réir an ordaithe.

2. D'fhonn atáirgtheacht agus íogaireacht mheasúnach mhaith a bhaint amach, tá sé riachtanach na plátaí a ní i gceart chun imoibrithe neamh-imoibrithe breise a bhaint.

3. Ba chóir na himoibrithe go léir a mheascadh go maith sula n-úsáidfear iad agus bumbles a sheachaint le linn sampla nó imoibrithe a shuimiú.

4. Má tá criostail déanta sa mhaolán níocháin tiubhaithe (20x), te go 37 ℃ agus measc go réidh go dtí go bhfuil na criostail tuaslagtha go hiomlán.

5. Seachain samplaí ina bhfuil Sóidiam Azide (NaN3) a mheas, mar d'fhéadfadh sé an ghníomhaíocht HRP a scrios agus mar thoradh air sin bheadh ​​meastachán ró-íseal ar an méid dsRNA.

6. Seachain éilliú RNase le linn measúnachta.

7. Is féidir an caighdeán/sampla, antasubstaint braite agus SA-HRP a dhéanamh freisin ag RT gan chroitheadh, ach d'fhéadfadh sé seo a bheith ina chúis le laghdú aonuaire ar íogaireacht braite.Sa chás seo, molaimid gur cheart caighdeáin UTP agus pUTP dsRNA a chaolú ó 2pg/μL, ba cheart caighdeáin N1-Me-pUTP dsRNA a chaolú ó 4pg/μL agus 5-OMe-UTP dsRNA caighdeánach a chaolú ó 8pg/μL.Ina theannta sin, gor réiteach oibre HRP-streptavidin ar feadh 60 nóiméad ag teocht an tseomra.Ná húsáid fleascán- chroiteoir, mar d’fhéadfadh toradh míchruinn a bheith mar thoradh ar chroiteoir fleascáin.

Toradh tipiciúil

1. Sonraí cuar caighdeánach

2. Ríomh cuar caighdeánach

3. Raon braite línéara:0.0312- 1pg/μL